沙眼衣原体（*Chlamydia trachomatis*，Ct）感染是导致不孕的主要原因，主要通过诱导输卵管纤维化来实现。上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在这一纤维化过程中发挥核心作用。然而，Ct感染触发EMT的分子机制尚未完全阐明。IFN-γ是Ct感染过程中宿主对感染上皮细胞施加免疫压力的主要成分之一。为在体外模拟这一免疫环境并研究宿主对Ct感染的信号应答如何影响EMT，研究人员在持续IFN-γ处理下维持Ct感染的HeLa细胞，并检测了Wnt/β-catenin和Notch信号通路。在该条件下，两条通路均被激活，并表现出可能涉及JAG1的功能性串扰（crosstalk）。抑制任一通路均可减弱EMT相关表型，并与感染性后代产量降低相关。这些发现支持Wnt/β-catenin–Notch串扰在持续IFN-γ处理下的Ct感染细胞中促进EMT的作用。
**论文解读：Wnt/β-catenin–Notch信号串扰在IFN-γ处理下促进沙眼衣原体感染诱导的上皮-间质转化**
**一、研究背景与科学问题**
沙眼衣原体（*Chlamydia trachomatis*，Ct）作为一种专性胞内细菌，是全球范围内最常见的细菌性传播感染病原体之一。多数感染女性无明显症状，导致感染未被及时发现和治疗，从而易于在生殖道建立持续性感染。若未接受治疗，上行感染可累及上生殖道，引起子宫内膜炎、输卵管炎和盆腔炎性疾病（pelvic inflammatory disease，PID），并导致输卵管阻塞、不孕和异位妊娠等严重后遗症。上生殖道Ct感染的一个重要后果是输卵管瘢痕化和纤维化，而越来越多的实验证据提示上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）可能参与这一病理重构过程。EMT过程中，上皮细胞逐渐失去顶端-基底极性和细胞间黏附，并获得与运动能力增强相关的间质特征，通常伴有E-钙黏蛋白（E-cadherin）表达降低以及波形蛋白（vimentin）和N-钙黏蛋白（N-cadherin）表达升高。
既往研究发现，Ct感染可激活宿主YAP依赖性转录和促纤维化信号，并可通过旁分泌信号刺激邻近成纤维细胞产生I型胶原。整合miRNA-mRNA分析也显示，上生殖道Ct感染女性的子宫内膜组织中，正常抑制TGF-β相关EMT通路的miRNA表达减少。然而，感染条件下协调这些反应的信号机制仍未完全阐明。在可能协调Ct感染期间EMT的信号网络中，Wnt/β-catenin和Notch通路尤其值得关注，因为二者均调控上皮可塑性和病理性组织重构。已有证据表明Ct可激活上皮细胞中的Wnt/β-catenin信号，Notch信号也被认为是EMT的调控因子，且在纤维化模型中观察到Wnt/β-catenin与JAG1/Notch轴之间的功能性相互作用。然而，Ct感染期间Wnt/β-catenin与Notch信号是否存在功能性偶联，以及这种偶联是否促进EMT，仍不清楚。
IFN-γ是Ct感染期间宿主免疫细胞分泌的主要细胞因子之一。在体内，IFN-γ上调吲哚胺2,3-双加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO），消耗色氨酸并对胞内Ct施加免疫压力。持续IFN-γ处理被广泛用于体外模拟持续免疫压力下的宿主-病原体相互作用。本研究在持续IFN-γ处理下比较未感染和Ct感染的HeLa细胞，以检测Wnt/β-catenin和Notch信号及EMT的变化，并进一步研究两条通路之间的功能相互作用、JAG1的潜在参与及其对EMT和感染性后代产生的影响。
**二、研究设计与主要技术方法**
研究人员采用持续IFN-γ（75 U/mL）处理的Ct感染HeLa细胞模型，模拟体内免疫压力环境。主要关键技术方法包括：（1）免疫荧光分析（immunofluorescence analysis，IFA），用于检测Ct包涵体形态及β-catenin、Notch-1、Hes1的亚细胞定位；（2）Western blot分析，检测β-catenin、Notch-1、JAG1及EMT标志物（E-cadherin、vimentin、N-cadherin）的蛋白表达水平；（3）CCK-8实验检测细胞增殖活性；（4）伤口愈合实验评估细胞迁移能力；（5）实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测NOTCH1和HES1 mRNA表达水平；（6）siRNA干扰技术敲低JAG1表达；（7）感染性后代滴定实验测定Ct感染性颗粒产量；（8）生物信息学分析，对研究人员前期已发表的RNA测序数据（NCBI SRA数据库BioProject登录号PRJNA1036572）进行基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析。
**三、主要研究结果**
**3.1 Ct感染细胞在持续IFN-γ处理下Wnt/β-catenin和Notch信号均被激活**
研究人员在持续IFN-γ处理下比较了未感染（mock）和Ct感染的HeLa细胞。Western blot分析显示，感染后12、24和40小时β-catenin蛋白水平进行性升高。免疫荧光分析表明，感染细胞中β-catenin主要定位于细胞核，而mock组β-catenin主要分布于细胞质；定量分析显示感染组中β-catenin核定位细胞百分比及核/质荧光强度比均显著升高，表明Wnt/β-catenin信号被激活。Notch-1蛋白水平在感染组中显著高于mock组，Notch-1及其下游效应分子Hes1在感染细胞中均表现出更高的核表达，且NOTCH1和HES1的mRNA水平也显著上调，表明Notch信号同样被激活。这些结果证实，在持续IFN-γ处理下Ct感染可同时激活Wnt/β-catenin和Notch信号通路。
**3.2 Wnt/β-catenin与Notch信号之间存在功能性串扰**
为探讨两条通路之间的关系，研究人员使用Wnt抑制剂IWP2或Notch抑制剂DAPT处理感染细胞。结果显示，IWP2以剂量依赖方式降低Notch-1表达，而DAPT处理则降低β-catenin表达。这种相互抑制效应表明Wnt/β-catenin与Notch信号之间存在功能性串扰。
**3.3 JAG1连接Wnt/β-catenin信号与Notch激活**
鉴于JAG1是Notch配体且为β-catenin的已知转录靶标，研究人员检测了JAG1的表达。Ct感染细胞在持续IFN-γ处理下JAG1蛋白水平显著高于mock组。IWP2处理可显著降低JAG1表达，提示Wnt/β-catenin信号参与JAG1的上调。进一步使用JAG1特异性siRNA敲低JAG1（敲低效率70.12%）后，Notch-1表达显著下降，表明JAG1支持Notch通路的激活。综合结果表明JAG1可能作为连接Wnt/β-catenin信号与Notch激活的分子桥梁。
**3.4 抑制Wnt/β-catenin或Notch信号可减弱EMT表型**
GO富集分析显示，持续IFN-γ处理下EMT相关生物学过程显著富集。Western blot证实感染组E-cadherin表达降低，vimentin和N-cadherin表达升高。CCK-8实验显示感染组细胞增殖活性在12小时和24小时分别比mock组高18.07%和36.69%。伤口愈合实验显示，感染组伤口闭合率在12小时（50.05%对26.58%）和24小时（56.99%对38.21%）均高于mock组。IWP2处理可恢复E-cadherin表达并降低vimentin和N-cadherin水平，DAPT处理产生相同效应模式。这些结果表明Wnt/β-catenin–Notch串扰在IFN-γ存在下促进Ct感染期间的EMT表型。
**3.5 抑制Wnt/β-catenin或Notch信号减弱EMT并降低感染性Ct后代产量**
CCK-8实验显示，Ct感染组细胞增殖信号比mock组高19.46%，IWP2处理使增殖降低27.63%，DAPT处理使其降低29.73%。伤口愈合实验中，12小时时Ct组伤口闭合率（50.05%）显著高于IWP2组（17.31%）和DAPT组（22.89%）；24小时时该模式持续存在（Ct组56.99%对IWP2组26.83%和DAPT组28.42%）。未感染细胞中IWP2或DAPT处理对基础伤口闭合无显著影响，排除了抑制剂的非特异性效应。感染性后代滴定实验显示，IWP2处理组的感染性后代滴度为（5.038 ± 0.219）× 10? IFU/mL，显著低于DMSO对照组（14.529 ± 1.660）× 10? IFU/mL；DAPT处理组为（2.994 ± 0.456）× 10? IFU/mL，显著低于DMSO对照组（13.288 ± 0.669）× 10? IFU/mL。这些结果表明，抑制Wnt/β-catenin或Notch信号可减弱EMT相关变化并降低Ct感染性后代的产生。
**四、讨论与结论总结**
讨论部分指出，既往研究已分别观察到Ct感染中Wnt/β-catenin和Notch信号的异常，但多在描述性或相关性水平上单独考察，二者的功能相互作用及其对EMT的影响尚不明确。本研究在持续IFN-γ处理条件下证实Ct感染同时激活两条通路，且抑制任一通路均可减弱另一通路的激活并减轻EMT相关表型，支持二者之间存在正向功能互作。JAG1作为β-catenin的转录靶标和Notch配体，可能构成连接两条通路的分子机制：β-catenin入核后诱导JAG1表达，JAG1进而促进Notch1活化和NICD核转位，形成促进EMT的Wnt/β-catenin–Notch串扰。此外，抑制任一条通路均降低感染性Ct后代产量，提示EMT相关的宿主细胞重构可能有利于Ct的胞内发育。研究局限性在于使用HeLa细胞不能完全再现人生殖道上皮的生物学复杂性，未来需要在原代生殖道上皮细胞中验证。
研究结论：本研究在持续IFN-γ处理下的Ct感染细胞中鉴定出Wnt/β-catenin与Notch信号之间的功能性串扰，该串扰可能涉及JAG1，并促进EMT相关变化。抑制任一通路均可减弱这些变化，并与感染性后代产量降低相关。
