墨西哥中部奶牛场呼吸道疾病犊牛支原体分离与PCR检测研究

背景： 传染性呼吸道疾病因高发病率、患病率和死亡率，给牛生产系统造成重大经济损失，主要影响幼龄动物。柔膜体纲（Mollicutes）细菌作为犊牛呼吸道疾病病原体日益受到关注，其中牛支原体（Mycoplasma bovis）是最受关注的物种。目前关于墨西哥中部奶牛犊牛呼吸道疾病相关支原体物种发生与分布的知识仍然匮乏。 目的： 本研究旨在利用细菌学和分子生物学方法，确定墨西哥中部山谷地区（具体为伊达尔戈州和墨西哥州）选定奶牛群中患有呼吸道疾病的犊牛体内支原体物种的发生情况。 方法： 研究人员开展了一项横断面便利研究，从5个奶牛群的150头2月龄以下、表现出呼吸道疾病症状的犊牛中采集鼻拭子样本。样本同时进行支原体细菌培养和PCR检测。采用靶向16S rRNA基因和16S–23S rRNA基因间区的PCR方法进行支原体属检测，并利用uvrC和rpoB基因进行物种特异性鉴定。通过代谢抑制试验进行血清学鉴定。使用卡方检验和Cohen's kappa系数进行统计分析。 结果： 通过PCR检测，150份样本中有85份（56.6%）支原体属阳性；通过培养和血清学鉴定，70份（46.6%）阳性。属水平上两种方法的一致性极佳（kappa = 0.802）。牛支原体（M. bovis）和差异支原体（M. dispar）是最常检出的物种，但各牛群间检出频率存在差异。牛支原体在A群和B群中占优势，而差异支原体在蒂萨尤卡地区的牛群中更为常见。牛鼻支原体（M. bovirhinis）在所有牛群中检出频率均较低。对rpoB和uvrC基因的测序分析显示，与不同地理区域的参考菌株具有高度一致性（96.7%–99.7%）。 结论： 整合PCR和培养方法的综合诊断策略可更全面地评估患有牛呼吸道疾病（BRD）犊牛中支原体属的存在情况。牛支原体和差异支原体是研究牛群中最常检出的物种。rpoB和uvrC基因测序（即使部分测序）代表了物种鉴定和流行病学调查的有用方法。

传染性呼吸道疾病是牛生产系统中造成经济损失的主要原因之一，具有高发病率、患病率和死亡率，主要影响幼龄动物，尤其是断奶前和育肥期犊牛，且在秋冬季节发生率增高。犊牛呼吸道疾病常因应激、管理不善和不利环境条件导致的免疫抑制而诱发，进而促进病毒和细菌病原体感染。呼吸道疾病影响约25%的一岁内犊牛，报告发病率在14%至38%之间，给养牛业造成重大经济损失。经济损失不仅与死亡率和治疗成本相关，还与慢性患病动物的饲料转化效率降低有关，最大影响来自生产性能下降。

柔膜体纲细菌作为犊牛呼吸道疾病的病原体日益受到关注。与犊牛呼吸道疾病最常相关的物种是牛支原体（Mycoplasma bovis），其次是差异支原体（M. dispar）、牛鼻支原体（M. bovirhinis），以及较少程度的产碱支原体（M. alkalescens）、加利福尼亚支原体（M. californicum）、精氨酸支原体（M. arginini）和丝状支原体丝状亚种小集落型（MmmSC）。其中，牛支原体因其侵袭潜力被认为最令人担忧，可引起支气管肺炎、关节炎、脑膜炎、中耳炎、角结膜炎、心内膜炎和褥疮性脓肿等全身性和局部感染。差异支原体与犊牛慢性化脓性支气管肺炎和慢性支气管间质性肺炎相关，但也从临床健康动物中分离到，其在呼吸道疾病中的作用仍存争议。牛鼻支原体通常被认为是机会性微生物，但2016年中国甘肃省某奶牛场暴发表明其可导致发病率超过50%的高度传染性呼吸道疾病。

目前关于墨西哥中部奶牛犊牛呼吸道疾病相关支原体物种的发生和分布知识仍然匮乏。因此，本研究旨在利用细菌学和分子生物学方法，确定墨西哥中部山谷地区（伊达尔戈州和墨西哥州）选定奶牛群中患有呼吸道疾病的犊牛体内支原体物种的发生情况。

研究人员开展了一项横断面便利研究，从伊达尔戈州和墨西哥州的5个奶牛群中采集150头2月龄以下、表现出呼吸道疾病症状（呼吸困难、呼吸急促、咳嗽、黏液脓性鼻分泌物、虚脱和虚弱）的犊牛鼻拭子样本。具体为：墨西哥州梅尔乔·奥坎波35头（A群）；伊达尔戈州阿克托潘30头（B群）；伊达尔戈州蒂萨尤卡3个牛群85头（C、D、E群）。每头动物同时采集两份鼻拭子：一份置于Amies转运培养基用于支原体培养，另一份置于3毫升无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中用于DNA提取和后续PCR分析。

研究采用的主要关键技术方法包括：细菌培养法，将样本接种于含20%马血清和1%葡萄糖的Friis液体培养基中，在37°C、5–10% CO?条件下培养5–7天，随后转种至固体培养基，通过代谢抑制试验使用单价抗血清进行血清学鉴定；DNA提取采用煮沸法；分子检测采用多种PCR方法，包括靶向16S rRNA基因1370 bp片段的终点PCR和靶向16S–23S rRNA基因间区的巢式PCR进行支原体属检测，牛支原体通过扩增uvrC修复基因1626 bp序列检测，差异支原体通过扩增rpoB基因548 bp区域鉴定，牛鼻支原体通过扩增rpoB基因397 bp片段检测；对选定的PCR产物进行Sanger测序，并在NCBI平台使用BLASTN进行序列比对以确认物种身份。统计分析使用卡方检验和Cohen's kappa系数。

支原体属检出频率： 在分析的150份鼻咽样本中，85份（56.6%，95% CI，48.3–64.7）PCR检测支原体属阳性。其中70份分离株根据形态学和生化特征被表型鉴定为支原体属，占总样本的46.6%（95% CI，38.5–54.9）。A群和E群的分离和PCR阳性率最高，分离率分别为60%（21/35）和56.6%（17/30），PCR阳性率分别为68.6%（24/35）和66.6%（20/30）。常规培养方法与PCR在支原体属检测方面的一致性kappa值为0.802，被评为极佳（95% CI，0.710–0.894）。

牛支原体检出： 牛支原体的检出频率在各牛群间存在差异，PCR检出率从8%到57.1%不等，培养检出率从8%到51.4%不等。两种诊断方法间一致性极佳，kappa值为0.891（95% CI，0.805–0.975）。A群和B群阳性样本比例较高，PCR阳性率分别为57.7%（20/35）和33.3%（10/30），培养和血清学鉴定阳性率分别为51.4%（18/35）和23.3%（7/30）。C、D、E群PCR阳性率分别为8%（2/25）、10%（3/30）和13.3%（4/30）。

差异支原体检出： 在蒂萨尤卡地区的牛群中，差异支原体是优势物种。PCR阳性率在C群为48%（12/25）、D群为30%（9/30）、E群为40%（12/30）。培养和血清学鉴定结果分别为32%（8/25）、26.6%（8/30）和36.6%（11/30）。rpoB PCR与培养分离株血清学鉴定之间的Cohen's kappa指数为0.904（95% CI，0.822–0.986），显示极佳一致性。

牛鼻支原体检出： 牛鼻支原体在各牛群中检出频率较低。D群和E群检出率最高，分别为10%（3/30）和13.3%（4/30），PCR和培养方法结果一致。A、B、C群未分离到该物种，但PCR在A群2份和B群2份样本中检测到该细菌DNA。培养与PCR检测牛鼻支原体的一致性kappa值为0.764（95% CI，0.543–0.986），分类为中等。

测序分析： 差异支原体分离株Tizayuca/2023和Melchor Ocampo/2023的rpoB基因测序显示，与GenBank中该物种对应序列具有96.7%–98.87%的一致性，包括中国菌株GS01（RefSeq: CP024161.1）、英国菌株NCTC10125（RefSeq: LR214971.1）和美国菌株ATCC 27140（RefSeq: CP007229.1）。牛鼻支原体分离株Tizayuca/2023的rpoB基因测序显示与英国型菌株NCTC10118（RefSeq: LR214972.1）、日本菌株HAZ141_2（RefSeq: AP018135.1）和中国菌株GS01（RefSeq: CP024049.1）具有98.89%–99.7%的一致性。牛支原体Melchor Ocampo/2023的uvrC基因虽未能获得完整1626 bp序列，但获得的514 bp部分序列与加拿大菌株Mb160（RefSeq: CP069057.1）和Mb1（RefSeq: CP069056.1）、德国菌株15DD0161（RefSeq: NZ_CP123290.1）和15DD0123（RefSeq: NZ_CP123289.1）、比利时菌株Mb229（RefSeq: CP058489.1）以及日本菌株KG4397（RefSeq: AP019558.1）的相应区域具有97.72%的一致性。

讨论总结： 本研究结果与墨西哥中部奶牛群先前研究报告的支原体属PCR检出率51.03%非常相似，证实了这些微生物在牛呼吸道疾病中的高频存在。PCR检出率高于培养方法，归因于分子技术更高的灵敏度，即使在活菌数量低或培养受抑制时也能检测到细菌DNA。研究还发现，在某些情况下，样本在液体培养基中增菌后PCR效率提高，该方法不仅提高灵敏度，还降低假阴性结果的可能性。值得注意的是，靶向16S rRNA基因的终点PCR在差异支原体扩增中存在不一致现象，表明广谱PCR检测可能对不同支原体物种存在分析灵敏度差异，而靶向16S–23S rRNA基因间区的巢式PCR因更高的分析灵敏度改善了支原体属的检测。与Maya等人的研究相比，本研究观察到不同的物种检出频率，提示与牛呼吸道疾病相关的支原体物种流行率可能存在时间性变化。培养培养基中添加葡萄糖可能促进了差异支原体的回收，因为该物种利用葡萄糖发酵生长。研究局限性包括：临床观察未系统记录和分析，无法评估支原体物种与临床表现严重程度之间的关联；仅使用鼻拭子样本，上呼吸道支原体检测不一定表明其参与下呼吸道疾病，也无法区分定植与活动性感染。完整测序1626 bp的uvrC扩增产物未始终成功，可能由于Sanger测序较长PCR产物的技术限制、内部测序引物退火效率、目标区域内潜在的二级结构和/或序列变异所致。尽管如此，所获序列足以完成本研究分析，表明uvrC基因在所测物种中高度保守。

结论： 本研究证明，结合PCR和培养方法的综合诊断策略可更全面地评估患有牛呼吸道疾病（BRD）犊牛中支原体属的存在情况。牛支原体和差异支原体是研究牛群中最常检出的物种。虽然牛支原体是公认的牛呼吸道病原体，但差异支原体在BRD中的作用仍不明确。然而，各牛群间观察到的不同分布模式为犊牛呼吸道疾病中支原体属的发生提供了有用的流行病学信息。此外，rpoB和uvrC基因的测序分析显示与不同地理区域的参考菌株具有高度一致性。这一发现表明这些基因在与牛呼吸道疾病相关的支原体物种中高度保守。因此，这些遗传标记的测序，即使是部分测序，也代表了物种鉴定和流行病学调查的有用方法。