泰国南部既往未报道省份食蟹猴（Macaca fascicularis）中嗜血支原体（Hemotropic Mycoplasma，hemoplasma）的分子检测与特征分析

摘要：嗜血支原体（Hemoplasmas，hemotropic Mycoplasmas）是无细胞壁的革兰氏阴性细菌，可在包括非人人灵长类（Non-human primates，NHPs）在内的多种哺乳动物中引起溶血性贫血。本研究调查了泰国南部三个既往未报道省份野生食蟹猴（Macaca fascicularis）中嗜血支原体的分子流行率及遗传特征。共采集攀牙府（Phang Nga）、碧武里府（Phetchaburi）和沙敦府（Satun）210份食蟹猴血液样本，提取DNA后采用靶向16S rRNA基因的广谱巢式聚合酶链反应（nested Polymerase Chain Reaction，nested PCR）进行筛查，阳性产物测序鉴定种属并构建系统进化树分析遗传关系。结果显示总体阳性率为35.7%（75/210；95% CI = 29.2–42.6%）。序列分析显示与候选支原体Candidatus（Ca.）Mycoplasma（M.）haematomacacae同源性达99.3–100.0%。系统进化分析确认所有序列均与来自泰国及其他国家食蟹猴已报道分离株聚于同一Ca. M. haematomacacae分支。研究表明，本研究首次提供Ca. M. haematomacacae感染泰国上述地区食蟹猴的分子证据，泰国各地食蟹猴可能作为该病原体的储库宿主。

嗜血支原体（Hemotropic Mycoplasma，hemoplasma）是一类缺乏细胞壁、不可体外培养的革兰氏阴性细菌，吸附于红细胞表面可诱导红细胞凋亡（eryptosis）并引起急/慢性溶血性贫血，主要通过吸血节肢动物或血液接触传播。非人灵长类（Non-human primates，NHPs）可作为多种hemoplasma的储库，其中Candidatus Mycoplasma haematomacacae（曾用名Candidatus Mycoplasma haemomacaque）已在泰国多地食蟹猴（Macaca fascicularis）、恒河猴（Macaca mulatta）及 Assam 猴（Macaca assamensis）中被检出，流行率差异较大（11.2%–59.64%）。泰国现存6种猕猴，食蟹猴广泛分布于南部并与人类社区高度重叠，存在潜在人畜共患病风险，但目前泰国仅部分府有hemoplasma报道，攀牙府（Phang Nga）、碧武里府（Phetchaburi）及沙敦府（Satun）此前无相关数据。为填补该空白，研究人员开展了上述三地食蟹猴hemoplasma分子流行率调查及Ca. M. haematomacacae遗传特征分析，相关成果发表于《International Journal for Parasitology: Parasites and Wildlife》。

研究人员于2023年5月至2024年6月采用便利抽样法采集泰国Phang Nga（30只）、Phetchaburi（71只）、Satun（109只）共210份自由放养食蟹猴EDTA抗凝血；采用QIAamp? DNA Blood Mini Kit提取全血基因组DNA；使用针对hemoplasma 16S rRNA基因的广谱巢式PCR（nested PCR，外引物V1-F/V9-R扩增~1400 bp，内引物V3-F/V6-R扩增~700 bp片段）进行检测，以Anaplasma platys DNA为阳性对照、ddH₂O为阴性对照；阳性扩增产物经Sanger测序后与GenBank序列BLAST比对；选取参比株采用ClustalW比对，MEGA 12软件基于Tamura-Nei模型最大似然法（Maximum Likelihood）构建系统进化树（1000次自举检验）；性别与地点感染差异采用Pearson卡方检验（GraphPad Prism 10，P < 0.05为显著）。

巢式PCR靶向16S rRNA基因~700 bp片段扩增显示，210份样本中75份阳性，总感染率为35.7%（75/210；95% CI = 29.2–42.6%）。分地点阳性率：Phetchaburi 36.6%（26/71）、Satun 35.8%（39/109）、Phang Nga 33.3%（10/30）；雄性35.7%（40/112）、雌性35.7%（35/98）。统计学显示性别（OR = 1.00，95% CI = 0.58–1.79，P > 0.999）及各采样地点间（Phetchaburi vs Phang Nga：OR = 1.16，P = 0.823；Satun vs Phang Nga：OR = 1.11，P > 0.999）感染率无显著差异。阳性产物测序比对表明所有序列与GenBank中已发表Ca. M. haematomacacae（日本猕猴AB820288、泰国Assam猴MZ960002、泰国食蟹猴MW040092）16S rRNA部分序列同源性为99.3–100.0%，所得序列已提交GenBank（登录号PX998692–PX998766）。系统进化树显示本研究所有序列与泰国食蟹猴（MW040088、MK192130）、恒河猴（MK192131）、Assam猴（MZ960020）、美国食蟹猴（KC512401）及日本猕猴（AB820288）来源的Ca. M. haematomacacae聚于同一进化支，而与其它hemoplasma物种明显分开，证实检出病原体为Ca. M. haematomacacae且泰国不同府及日本分离株间16S rRNA高度保守。

讨论部分指出：本研究首次在泰国Phang Nga、Phetchaburi及Satun三省食蟹猴中检出Ca. M. haematomacacae，35.7%的流行率高于泰国部分既往报道（Assam猴17.3%、食蟹猴11.2%）但低于另些研究（食蟹猴55.1%、美国食蟹猴84.6%），差异可能与采样群体、检测方法及猴群密度有关。尽管感染猕猴通常无症状，但其可作为储库维持病原体在种群内循环并具跨种传播潜在风险。本研究未发现性别、采样地对感染率的显著影响，与部分国内外研究结果不一致，可能受样本量或群体行为差异影响。序列比对发现三省分离株间及与泰国其他府已发表Ca. M. haematomacacae序列无核苷酸差异，与日本株仅少数变异，说明Ca. M. haematomacacae 16S rRNA基因地理及宿主间高度保守、遗传多样性低。鉴于人与食蟹猴生境重叠密切且其它动物源hemoplasma有人感染报道，需加强对该菌的人畜共患监测。本研究局限为仅用16S rRNA单基因标记、未做血常规与临床评估、未调查潜在节肢动物媒介及同居人群感染情况。

结论（翻译）：本研究提供了泰国此前未报道的碧武里府、沙敦府及攀牙府食蟹猴感染Candidatus Mycoplasma haematomacacae的分子证据。未来应在泰国不同地区多种非人灵长类中开展hemoplasma调查，并对共享生境的人群进行监测，以更好理解其传播动力学及潜在人畜共患风险。