奶山羊中小反刍动物慢病毒(Small Ruminant Lentivirus, SRLV)与支原体属(Mycoplasma spp.)混合感染的伴生流行：基于临床及多样本诊断方法的研究

摘要：奶山羊群的健康可受小反刍动物慢病毒（Small Ruminant Lentivirus, SRLV）及无乳支原体（Mycoplasma agalactiae）感染损害，尤其在混合感染（coinfection）条件下更为严重。本研究调查了巴西北部一存栏38头、有关节肿大及产奶量下降病史的奶山羊群。研究人员采集血液、乳汁、滑液及眼拭子样本，进行临床检查、血清学、分子生物学及系统发育分析。临床上，28.9%（11/38）的动物出现关节炎，28.9%（11/38）出现角膜结膜炎，泌乳母羊中19.4%（6/31）出现乳腺炎或无乳症。SRLV诊断中，琼脂凝胶免疫扩散试验（Agar Gel Immunodiffusion, AGID）阳性率为31.6%（12/38），间接酶联免疫吸附试验（Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, 间接ELISA）阳性率为65.8%（25/38），两法一致性中等（K = 0.387；P = 0.002）。支原体属（Mycoplasma spp.）间接ELISA检出抗体阳性率34.2%（13/38）；PCR从滑液中检出无乳支原体（M. agalactiae）阳性率83.3%（5/6），眼拭子66.7%（2/3），乳汁79.3%（23/29）。混合感染的临床体征仅见于SRLV与M. agalactiae共同感染的动物。基于16S rRNA基因的系统发育分析支持了M. agalactiae的分子鉴定。上述结果表明所调查羊群中存在SRLV与M. agalactiae的伴生流行，并强调了结合临床评估与针对不同生物样本开展血清学及分子检测对诊断山羊混合感染的重要性。

山羊养殖在巴西东北部等地区具有重要社会经济意义，但羊群健康常受传染性疾病威胁。小反刍动物慢病毒（Small Ruminant Lentivirus, SRLV；又称山羊关节炎脑炎病毒CAEV）引起慢性、进行性多器官损害，包括关节炎、乳腺炎；无乳支原体（Mycoplasma agalactiae）是传染性无乳症（Contagious Agalactia, CA）的主要病原，可致乳腺炎、关节炎及角膜结膜炎。两者临床表现存在重叠，且混合感染（coinfection）可能加重疾病、干扰诊断。SRLV存在血清阳转延迟，支原体（Mycoplasma）在乳汁等样本中呈间歇性排菌，单一诊断方法易漏检。目前关于巴西北部奶山羊群中SRLV与支原体混合感染并采用多样本联合诊断的研究有限。因此，研究人员以巴西北半球伯南布哥州（Pernambuco）一出现关节肿大和产奶下降的临床发病羊群为对象，开展临床、血清学、分子及系统发育综合研究，明确SRLV与M. agalactiae的混合感染状况及多样本诊断价值。该论文发表于《Veterinary Research Communications》。

研究人员调查巴西伯南布哥州Sanharó市一存栏38头成年奶山羊（36雌、2公，含萨能Saanen、阿尔卑斯Alpine、吐根堡Toggenburg及杂交种）的半集约化管理羊群（有近期购入及转运史）。逐头做临床体检（关节触诊、乳腺及strip cup试验、眼检查），采集全血（有抗凝/无抗凝）、乳汁（n=29）、滑液（关节穿刺，n=7份中可用6份）、眼拭子（n=3）；血清分作琼脂凝胶免疫扩散试验（AGID）及间接ELISA（商用多表位重组肽试剂盒）检测SRLV抗体，另有自建间接ELISA检测支原体（Mycoplasma spp.）抗体；各类样本经煮沸法提取DNA后先行软壁菌门（Mollicutes）通用PCR（16S rRNA引物Van Kuppeveld等），阳性者再行M. agalactiae、M. conjunctivae及M. mycoides subsp. capri种特异性PCR，选扩增产物做Sanger测序及最大似然法（Maximum Likelihood, ML）系统发育树分析（基于16S rRNA基因，MUSCLE比对、GTR模型、500次自举检验）；部分关节炎羊做血常规及生化（红细胞压积、白细胞计数、血浆总蛋白、纤维蛋白原）；血清学与临床关联用卡方/Fisher精确检验，AGID与ELISA一致性用Cohen's kappa分析（R软件）。

38头山羊中47.4%（18/38）出现关节炎、角膜结膜炎、无乳/乳腺炎中至少一种体征。关节炎发生率28.9%（11/38），以双侧腕关节受累为主，伴触痛、跛行甚至侧卧不起；泌乳母羊（n=31）中乳腺炎和无乳各占9.7%；角膜结膜炎28.9%（11/38），多为双侧；42.1%见疑似干酪样淋巴结炎（Caseous Lymphadenitis, CLA）体表淋巴结肿大，18.4%见乳腺乳头状瘤。研究人员得出结论：该群呈现典型SRLV相关关节炎与M. agalactiae相关传染性无乳症的多系统临床综合征。

SRLV血清学：间接ELISA阳性率65.8%（25/38），AGID 31.6%（12/38），所有AGID阳性者ELISA亦阳性，两法一致性中等（K=0.387, P=0.002）。统计学显示关节炎与SRLV血清阳性（ELISA及任一项阳性）显著相关（P=0.01及P=0.006）。支原体检测：间接ELISA抗体阳性34.2%（13/38）；Mollicutes通用PCR在全部6份关节炎羊滑液中阳性，其中83.3%（5/6）为M. agalactiae种特异性PCR阳性；眼拭子M. agalactiae PCR阳性66.7%（2/3）；乳汁M. agalactiae PCR阳性79.3%（23/29）。混合临床体征（同时有关节炎+角膜结膜炎或乳腺炎/无乳）仅见于SRLV与M. agalactiae均阳性的混合感染动物。部分无症状羊乳汁或滑液仍可PCR检出M. agalactiae，部分有结膜炎但血清双阴者眼拭子/PCR仍阳性，提示病原体组织定植可早于或独立于可检出抗体。研究人员得出结论：单一血清学易低估感染率，多样本分子检测可提高病原检出；SRLV与M. agalactiae在该群中共存且混合感染与复合临床表现相关。

对临床样本PCR产物进行Sanger测序并构建系统发育树，所得序列与GenBank中已发表M. agalactiae参考株聚于同一高支持率（bootstrap ≥80%）分支，且与M. conjunctivae、M. mycoides subsp. capri等其它小型反刍动物支原体明显分开。研究人员得出结论：分子鉴定确为M. agalactiae，排除其他支原体种混淆。

讨论指出，本羊群存在SRLV与M. agalactiae混合感染，两者临床综合征重叠（关节炎、乳腺炎、角膜结膜炎），转运应激及管理条件差可能诱发潜伏感染显性化。M. agalactiae具泛组织嗜性（pantropic），可从滑液、乳汁、眼部分离；SRLV致慢性关节炎且所有关节炎羊均SRLV血清阳性（至少一法），支持SRLV在关节病变中的作用。血清学ELISA比AGID敏感（尤其早期或低滴度感染），但仍无法检出病原直接存在；PCR直接从组织/分泌物检出DNA弥补了抗体应答延迟或间歇排菌造成的漏诊。部分亚临床感染动物多样本PCR阳性提示隐性带菌/排毒。研究局限为单群横断面调查，不做广泛流行病学推估。

结论（翻译）：研究人员在被调查的奶山羊群中确认了SRLV与无乳支原体（M. agalactiae）的混合感染（coinfection），该群动物表现关节炎、角膜结膜炎及泌乳障碍等临床症状。临床体征的重叠凸显了现场诊断的复杂性。研究结果表明，将临床评估与血清学及分子检测方法相结合，并对不同生物样本（血液、乳汁、滑液、眼拭子）进行分析，对提高山羊群感染性疾病尤其是混合感染的检出与判定具有重要意义。