猪链球菌是猪的重要致病菌，也是导致人类严重感染的新兴病原体，其抗菌药物耐药性日益受到关注。本研究评估了健康猪中猪链球菌的流行情况及血清阳性率，并对定植菌株的抗菌药物敏感性、血清型、毒力相关基因和基因组特征进行了表征。研究人员共采集了58头猪（13头农场猪和45头屠宰场猪）的样本。通过培养获得的176株疑似分离株中，有60株经聚合酶链式反应（PCR）确认为猪链球菌，并随后进行了分析。抗菌药物敏感性通过纸片扩散法测定，选定的耐药基因和毒力基因通过常规PCR检测，并对两株代表性分离株进行了全基因组测序（WGS）和比较基因组分析。血清阳性率通过使用检测猪链球菌血清型2抗原免疫球蛋白G抗体的间接酶联免疫吸附试验（ELISA）确定。在176株疑似分离株中，有60株（34.1%）被确认为猪链球菌，最常见于鼻拭子和扁桃体，而血液样本中未检测到分离株。血清阳性率为65.5%。观察到对头孢曲松、氨苄西林、头孢吡肟、克林霉素和四环素的高耐药率，且多重耐药现象普遍。四环素和大环内酯类相关耐药基因被频繁检出。血清型2/1/2占主导地位，而主要的经典侵袭性毒力基因未被检测到，这与主要为定植菌株的情况一致。对两株代表性分离株进行的全基因组测序证实了其物种身份，并揭示了显著的基因组多样性，包括一株扁桃体分离株具有明显更大的基因组，表明获得了附属遗传元件。这些发现表明，健康猪可携带基因多样且具有抗菌药物耐药性的猪链球菌，这突显了持续监测对于支持抗菌药物管理和减少人畜共患病风险的重要性。
**论文解读：泰国健康猪源猪链球菌的表型与基因组特征研究**
**研究背景与问题**
猪链球菌是一种革兰氏阳性球菌，通常定植于猪，也是导致猪脑膜炎、败血症、关节炎和猝死的重要病原体，给养猪业造成重大经济损失。同时，它已成为一种重要的人畜共患病原体，可导致人类严重的疾病，包括脑膜炎、败血症、感染性心内膜炎等。在东南亚，特别是泰国，由于生猪生产实践和特定的饮食习惯（如食用生猪肉菜肴），猪链球菌造成的人类疾病负担尤为突出。抗菌药物耐药性在猪链球菌中的出现，对兽医治疗和公共卫生构成了日益严峻的挑战。泰国的监测项目已报告对大环内酯类和四环素类持续存在高水平耐药，尽管β-内酰胺类和酰胺醇类药物通常仍有效，但耐药模式因地区、时间和菌株谱系而异。目前尚无广泛有效的猪链球菌疫苗，因此抗菌药物仍是疾病治疗和控制的主要手段。然而，关于泰国猪场和屠宰场猪链球菌分离株的抗菌药物敏感性模式、毒力基因谱和遗传多样性的数据仍然有限。全面表征这些特征对于指导合理用药、改进疾病控制策略以及降低猪肉生产链中的人畜共患病风险至关重要。本研究旨在确定从猪分离的猪链球菌的流行率和血清阳性率，并表征其抗生素敏感性、毒力基因的存在情况以及基于草图全基因组的基因组特征。该论文发表在《Antibiotics》期刊上。
**主要技术方法**
研究人员在泰国那空是贪玛叻府采集了58头猪（13头来自商业猪场，45头来自当地屠宰场）的161份生物样本，包括鼻拭子、扁桃体拭子和血液样本。通过培养和PCR进行菌株鉴定与确认。使用间接ELISA检测针对猪链球菌血清型2的IgG抗体以确定血清阳性率。采用Kirby-Bauer纸片扩散法对所有PCR确认的分离株进行抗菌药物敏感性试验。通过常规PCR对选定分离株进行四环素类和大环内酯类耐药基因（tetO、tetM、ermA、ermB、mefA）和毒力相关基因（arcA、bay046、epf、hyl、mrp、sly）的检测。使用多重PCR对分离株进行血清型（1、1/2、2、5、7、8、9、14、16型）分子分型。基于其多重耐药谱和高多重抗生素耐药指数，选择了一株鼻拭子分离株（NS05）和一株扁桃体拭子分离株（T14）进行Illumina平台全基因组测序，并利用一系列生物信息学工具进行基因组组装、物种确认、耐药基因和毒力基因鉴定、比较基因组及系统发育分析。
**研究结果**
**1. 猪链球菌流行率与血清型2血清阳性率**：从58头猪的161份样本中，通过培养获得176株形态学疑似分离株。经PCR确认，60株（34.1%）为猪链球菌，其中鼻拭子（34/89，38.2%）和扁桃体拭子（26/76，34.2%）阳性率较高，血液样本（0/11）未检出。针对血清型2的间接ELISA检测显示，血清阳性率为65.5%。
**2. 抗菌药物敏感性**：对60株确认菌株的药敏试验显示，对头孢曲松（73.33%）、氨苄西林（71.67%）、克林霉素（71.67%）、头孢吡肟（68.33%）和四环素（61.67%）的耐药率最高。对氯霉素（10.00%）、万古霉素（20.00%）和左氧氟沙星（20.00%）的耐药率较低。多重耐药现象普遍，39株菌对三类或更多抗菌药物类别耐药。
**3. 抗菌药物耐药基因分布**：对30株菌的检测显示，tetM（90.00%）和tetO（80.00%）检出率最高，其次是大环内酯类耐药基因mefA（76.67%）和ermB（70.00%）。四环素耐药基因总体比大环内酯类耐药基因更普遍。
**4. 分子分型检测**：血清型分布显示，血清型2/1/2（30.0%）是主要血清型，其次是血清型8（21.7%）、血清型1和14（16.7%）、血清型5（13.3%）和血清型16（5.0%）。血清型7和9未检出。
**5. 毒力基因检测**：在60株菌中，bay046基因检出率最高（93.3%），其次是arcA基因（70.0%）。mrp基因仅在3株菌（5.0%）中检出。经典的侵袭性毒力基因epf、hly和sly在所有菌株中均未检出。血清型2/1/2菌株携带毒力相关基因的比例最高。
**6. 全基因组测序**：对NS05（鼻源）和T14（扁桃体源）两株菌进行WGS。T14的基因组（3，846，008 bp）明显大于NS05（2，183，810 bp），且组装连续性更好。两株菌均携带多种抗菌药物耐药决定簇，涉及抗生素失活、靶点修饰、靶点保护、靶点替换和调控调节等多种机制，但具体基因存在差异（如NS05携带tetW，T14携带tetO；氨基糖苷类修饰酶基因也不同）。T14还检测到了万古霉素相关基因（如vanY）。
**7. 基于七个看家基因串联核苷酸序列的分析**：系统发育分析证实，NS05和T14均聚类于猪链球菌谱系内，与参考菌株BM407和05ZYH33形成具有100%自举支持率的单系分支，表明准确的物种水平鉴定。
**8. 基因组图谱**：全基因组图谱分析显示，两株菌的染色体均呈现典型的双向复制模式。利用CARD数据库进行的抗性组分析鉴定出多种抗菌药物耐药决定簇，并在染色体上观察到耐药基因成簇现象，提示可能通过可移动遗传元件获得。
**9. 荚膜多糖生物合成基因簇的比较分析**：对cps基因簇的比较分析显示，两菌株在整体基因组织结构上高度保守，但在中央可变区存在局部变异，包括糖基转移酶相关基因的差异以及一个菌株中存在而另一个中缺失或 divergent 的基因组片段，这可能导致荚膜组成差异。
**10. 荚膜多糖生物合成簇内基因的功能注释**：功能注释鉴定出参与荚膜生物合成和输出的多个基因，包括糖基转移酶、糖修饰酶和ABC转运蛋白组分，表明存在完整的多糖组装途径。同线性分析显示基因方向保守，但基因内容和序列相似性（69–100%）存在变异。
**11. 平均核苷酸一致性**：使用FastANI评估T14与参考基因组NS05的全基因组相关性，得到的平均核苷酸一致性为95.06%，处于物种界定阈值（95–96%），证实两者属于同一物种但代表不同的基因组谱系，且T14存在附属基因组扩张。
**讨论与结论总结**
研究讨论部分指出，本研究中猪链球菌的检出率（34.1%）以及鼻拭子和扁桃体拭子为主要定植部位的结果，与已知的该菌生态学一致，且与之前中国健康猪的报道相似。血液样本未检出菌株则符合其机会致病特性。观察到的高耐药率，特别是对四环素、大环内酯-林可酰胺类以及β-内酰胺类药物的耐药，可能反映了养猪生产中这些抗菌药物的广泛使用。多重耐药现象普遍，且耐药基因（如tetM、tetO、ermB）的检出与全球报道一致，水平基因转移可能在耐药性传播中起重要作用。血清型2/1/2是最常检测到的血清型，这与该血清型在猪和人类疾病中的重要性相符。毒力基因谱以定植相关基因（bay046、arcA）为主，而经典侵袭性毒力基因（epf、sly、hly）缺失，表明本研究回收的菌株主要代表定植群体，但血清型2/1/2菌株携带毒力相关基因的比例最高，其致病潜力不容忽视。全基因组测序证实了两株菌的物种身份，并揭示了显著的基因组可塑性，特别是扁桃体分离株T14的基因组扩张，这可能与水平基因转移、可移动遗传元件整合有关。两菌株携带了多样化的耐药决定簇和cps基因簇变异，强调了鼻和扁桃体生态位作为遗传多样性和抗菌药物耐药基因储存库的作用。平均核苷酸一致性值（95.06%）支持了两菌株属于同一物种但为不同谱系的结论。
**研究结论**（翻译）：本研究证实，猪链球菌普遍存在于猪的上呼吸道，特别是鼻腔和扁桃体生态位，是其传播的重要储存库。多重耐药的高流行率，包括广泛存在的四环素和大环内酯类耐药决定簇，反映了养猪生产中巨大的抗菌药物选择压力，并引发了兽医和公共卫生方面的担忧，尤其是在人畜共患血清型2和1/2占主导地位的情况下。全基因组分析揭示了显著的基因组多样性，包括附属基因组扩张和cps基因座的变异性，凸显了该物种的基因组可塑性和水平基因转移能力。总而言之，这些发现强调了在“一体健康”框架内，持续进行基因组监测和负责任的抗菌药物管理对于减缓侵袭性和耐药性猪链球菌谱系出现和传播的重要性。
