细胞外囊泡（EVs）是通过将细胞质物质从供体细胞转移到受体细胞来实现细胞间通讯的天然介质。调控EV摄取和货物递送到受体细胞的分子机制仍然大多未知。为了填补这一空白，研究人员对动态表面组的300个基因进行了遗传筛选，以探究它们在EV摄取中的作用。筛选发现的激活因子建立了EV摄取与Wnt通路之间先前未知的联系。随后，研究人员观察到，与主要被转运至受体细胞溶酶体的无WNT（WNT-na?ve）EVs不同，携带WNT5A的EVs滞留在早期内吞结构中。这种重定向依赖于RYK（一种已知的WNT5A共受体）的表达。研究结果揭示了EV功能异质性的潜在机制，并揭示了非经典WNT信号传导的潜在调控系统。
**论文解读：WNT5A/RYK轴决定细胞外囊泡的细胞内命运**
**研究背景与问题**
细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）是细胞间通讯的重要媒介，通过转移蛋白质、脂质和核酸等物质在供体与受体细胞之间传递信号。然而，EVs被受体细胞摄取及货物释放的分子机制仍不清楚。尽管已发现部分配体-受体相互作用可引导EVs靶向特定细胞，但EVs的趋向性通常被认为较为广泛，且其摄取过程似乎不依赖单一受体，主要通过液相胞饮（macropinocytosis）进入细胞。同时，EVs可携带疏水性形态发生素如WNT（wingless-related integration site）和Hedgehog，但WNT修饰的EVs在受体细胞中的具体命运——尤其是与特定受体-共受体复合物的相互作用——尚未阐明。本研究旨在通过遗传筛选鉴定调控EV摄取的分子机制，并重点关注WNT修饰EVs的独特行为。
**研究内容与结论**
研究人员在HeLa细胞中针对动态表面组（dynamic surfaceome）的300个基因进行了阵列式CRISPR-Cas9遗传筛选，发现EV摄取激活因子中有20个与Wnt通路相关。进一步实验表明，携带WNT5A的EVs（Wnt5A-EVs）在受体细胞中不被转运至溶酶体降解，而是滞留在早期内体（early endosomes）中，并增强货物释放到胞质。这一重定向依赖于受体细胞表面RYK（一种WNT5A共受体）的表达，且不依赖WNT信号传导。研究揭示了WNT5A/RYK轴作为EV命运决定因子的新机制，并为非经典WNT信号调控提供了潜在见解。该论文发表在《SCIENCE ADVANCES》。
**主要关键技术方法**
1. **阵列式CRISPR-Cas9遗传筛选**：针对HeLa细胞动态表面组300个基因，设计sgRNA文库进行单基因敲除，结合荧光素酶标记的EV摄取实验和细胞活力检测（alamarBlue），筛选EV摄取调控因子。
2. **EV标记与功能分析**：利用NanoLuciferase（NL）标记CD63或HSP70作为EV报告分子，通过荧光素酶活性定量EV摄取、降解、回收和货物递送效率。
3. **荧光共聚焦显微镜及超分辨成像**：使用GFP标记的EV与RFP标记的早期内体（Rab5）或晚期内体（CD63）标记物，结合增强型超分辨径向波动（aSRRF）技术，观察EV亚细胞定位。
4. **免疫金标记与相关光镜/电子显微镜（CLEM）**：确认WNT5A暴露于EV表面，并检测其与RYK的相互作用。
5. **基因敲低与功能验证**：通过siRNA或CRISPR-Cas9敲低RYK、ROR1、LRP5/6等共受体，评估对Wnt5A-EV重定向的影响。
**研究结果**
**1. 遗传筛选鉴定WNT通路为EV摄取的调控因子**
通过对300个动态表面组基因的阵列式CRISPR筛选，研究人员发现48个EV摄取激活因子，其中20个与Wnt通路相关（基于已发表证据或BioGRID相互作用网络），提示WNT信号可能参与EV摄取调控。
**2. WNT5A修饰的EVs逃避溶酶体降解**
在HeLa受体细胞中，与无WNT（mock）或WNT3A修饰的EVs相比，WNT5A修饰的EVs在溶酶体蛋白酶抑制剂E64d存在下累积减少，E64d/未处理比值显著降低，表明Wnt5A-EVs较少被转运至溶酶体降解。这一现象在HEK293和HeLa两种供体细胞以及不同EV标记（NLCD63和NLHsp70）中均得到验证。
**3. WNT5A-EVs滞留在早期内体并增强货物递送**
共聚焦显微镜显示，Wnt5A-EVs在摄取7小时后仍与早期内体标记物RFP-Rab5共定位，而无WNT EVs则转移至晚期内体/溶酶体（RFP-CD63）。aSRRF超分辨成像确认Wnt5A-EVs存在于500–600 nm的Rab5阳性结构中。此外，Wnt5A-EVs的回收减少，而货物递送到胞质的比例显著增加。
**4. WNT5A暴露于EV表面并由共受体RYK介导重定向**
免疫金标记和CLEM实验证实WNT5A-V5暴露于EV表面。免疫分离实验显示，抗V5抗体可特异性捕获携带WNT5A的EVs，且该捕获依赖完整的EV膜。在RYK敲低的受体细胞中，Wnt5A-EVs的溶酶体逃避效应消失，其与晚期内体标记物的共定位恢复，表明RYK是介导重定向的关键共受体。其他WNT共受体（ROR1、LRP5/6）无此作用。结合实验进一步表明，Wnt5A-EVs与受体细胞的结合依赖RYK，且可被分泌型WNT抑制因子WIF-1竞争性抑制。
**5. WNT信号通路对EV摄取的不同影响**
经典WNT通路激活剂ChIR99021（GSK3抑制剂）通过促进巨胞饮作用增强整体EV摄取，而非经典WNT配体Wnt5A则通过减少溶酶体降解来调控EV命运。但Wnt5A-EVs的重定向不依赖信号传导，因为实验中使用的EV数量不足以触发可检测的WNT信号。
**讨论与结论**
本研究通过无偏倚的遗传筛选，鉴定出WNT5A为EV在受体细胞中命运的决定因子。WNT5A修饰的EVs通过与共受体RYK的特异性相互作用，在质膜水平被重定向至早期内体，避免进入溶酶体降解途径，并增强货物释放。经典WNT信号通过促进巨胞饮作用增加EV整体摄取，而非经典WNT信号则通过RYK依赖的内化选择性阻止Wnt5A-EVs的溶酶体清除。两种机制协同可能为WNT依赖的生理功能提供高效调控方式。研究不仅扩展了对EV摄取分子机制的理解，还提出了非经典WNT信号传导的新假说：Wnt5A-EVs的滞留可能通过信号体稳定化实现信号放大。然而，该机制是否代表普遍性调控途径，或仅与特定WNT功能相关，仍需在更复杂的体内系统中验证。目前，研究人员提出WNT5A可作为定义一种新型EV亚型的标志物，该类EVs具有溶酶体重定向特性，但其功能意义和分子组成有待进一步研究。
