综述：利用DNA损伤耐受机制实现精准肿瘤治疗

未解决的DNA损伤会引发复制应激，迫使癌细胞劫持DNA损伤耐受（DDT）网络，特别是跨损伤合成（TLS）和模板转换（TS），以维持复制进程。虽然DDT可防止致命的复制叉崩溃，但易错的TLS会驱动突变发生、肿瘤演化、化疗耐药和放疗抵抗。增殖细胞核抗原（PCNA）的翻译后修饰动态调控着通路选择。癌细胞利用这种可塑性，产生了诸如复制后单链DNA（ssDNA）缺口等可利用的脆弱性。新兴抑制剂靶向TLS聚合酶、上游调控因子如泛素特异性肽酶1（USP1）以及关键的蛋白质-蛋白质相互作用，为精准肿瘤治疗提供了前所未有的机遇。通过将DDT抑制与同源重组缺陷（HRD）和肿瘤突变负荷（TMB）等生物标志物相结合，我们可以驱动合成致死效应、增敏肿瘤对基因毒性药物的反应、抑制治疗诱导的突变发生，并可能增强对免疫疗法的应答。

基因组完整性持续受到基因毒性应激的挑战。当损伤逃避了经典的DNA损伤应答（DDR）途径并在S期持续存在时，细胞必须启动DNA损伤耐受（DDT）。DDT作为一个高度协调的网络运作，包含核心策略——跨损伤合成（TLS）、模板转换（TS）和复制叉重塑——允许复制在受损模板上进行，从而防止致命的复制叉崩溃。在当代肿瘤学中，DDT日益被视为一把双刃剑。癌基因诱导的复制应激和经典修复途径的缺陷迫使肿瘤进入对DDT途径的高度依赖状态以维持增殖。虽然DDT确保在基因毒性化疗的急性应激下存活，但其易错的TLS分支却驱动了突变发生、克隆演化和获得性治疗耐药。理解肿瘤细胞如何劫持这些耐受网络，正在开辟一个全新的精准治疗前沿，旨在利用这把双刃剑的两个刃：既靶向肿瘤对DDT的依赖性，又限制驱动克隆演化和治疗耐药的致突变过程。

DDT通过一组有限的、机制上不同的途径使复制能够在未修复的DNA损伤上进行，这些途径在速度与保真度之间取得平衡。

跨损伤合成（TLS）是最直接的损伤旁路机制，利用专门的、低保真度的DNA聚合酶。所有这类酶都具有灵活的活性位点，能够容纳扭曲的DNA模板，通常通过两步机制运作：“插入”聚合酶在损伤对面掺入一个核苷酸，随后由Pol ζ介导延伸。作为最快的DDT途径，TLS优先考虑快速的复制叉推进，而牺牲复制保真度。

与TLS相反，模板转换（TS）提供了一种较慢但基本无错误的损伤旁路机制，它利用未受损的姐妹染色单体作为模板。这种类似重组的机制允许复制机器在不复制受损DNA的情况下绕过损伤，并且经常与复制后单链DNA（ssDNA）缺口填充相偶联。PrimPol介导的重新引发机制通过使得复制叉继续推进同时将损伤解决推迟到复制后缺口填充途径，促进了这一过程。值得注意的是，并非所有与复制相关的ssDNA缺口都源于同一机制。除了由PrimPol重新引发产生的生理性复制后缺口外，ssDNA缺口也可能在停滞的复制叉处或其附近产生，原因是保护缺陷、碱基切除修复（BER）中间体的加工或同源重组缺陷（HRD）。尽管这两类缺口都增加了对DDT途径的依赖，但它们在起源和生物学后果上机制不同。

复制叉重塑是DDT的关键第三层，用于稳定停滞的复制叉以促进最终重启。与TLS或TS不同，复制叉重塑并不直接绕过DNA损伤。相反，它会暂时延迟DNA合成以稳定停滞的复制叉，优先考虑基因组完整性而非复制速度，同时为准确的复制重启创造条件。SMARCAL1、ZRANB3和HLTF等转位酶介导复制叉重组为四向连接。叉保护关键依赖于BRCA1和BRCA2等因子，它们稳定RAD51丝状体以防止MRE11和DNA2对复制相关ssDNA缺口的核酸酶加工。最近的生化和结构研究揭示了RAD51在DNA复制过程中的额外功能。超越其在同源重组（HR）中的经典作用，RAD51核丝状体优先识别BER和内源性碱基修饰途径中产生的含AP位点的DNA。RAD51核丝状体在含AP位点DNA上的组装保护这些损伤免受MRE11依赖性的切割，从而限制复制叉断裂并抑制有毒ssDNA缺口的积累。同样，结构见解揭示EEPD1作为一个DNA夹钳二聚体物理性地保护逆转的复制叉免受核酸酶攻击。这种多蛋白叉保护机制在BER中间体、DDT、HR和HR缺陷细胞中Pol θ依赖性缺口填充之间建立了直接的分子联系。BRCA1的招募以协调叉保护和随后的末端切除受到局部表观遗传景观的严格调控。在HRD背景下，未受保护的逆转复制叉会成为灾难性核酸酶降解的目标，这是交联剂和PARP抑制剂细胞毒性的主要机制。总之，尽管DDT、复制叉保护和经典DNA修复紧密相连，但它们服务于不同的生物学功能。

易错和无错误损伤旁路之间的选择由增殖细胞核抗原（PCNA）的翻译后修饰控制，PCNA作为指导DDT通路选择的中央交换台。PCNA并非作为静态支架，而是充当动态信号枢纽。PCNA在赖氨酸164（K164）处的单泛素化降低了聚合酶交换的门槛，用专门的、低保真度的TLS聚合酶取代复制型聚合酶。反之，将此标记延伸为K63连接的聚泛素链则促进无错误的TS。除了泛素化，PCNA的SUMO化作为一种重要的调节平衡器，在活跃的DNA复制过程中抑制不当的HR。从机制上讲，SUMO化的PCNA招募抗重组解旋酶，这些解旋酶积极拆解RAD51核蛋白丝状体并限制重组中间体的延伸。重要的是，该系统具有复杂的分子串扰：SUMO化的PCNA可以直接作为泛素连接酶的底物。这种SUMO到泛素的传递使得在主动抑制重组与快速激活损伤旁路途径之间能够进行协调过渡。对治疗靶向至关重要的一点是，这个交换台是可逆的。去泛素化酶，特别是USP1/UAF1复合物，一旦损伤被绕过，就会移除PCNA上的泛素以终止TLS。在癌症中，这些泛素化循环的失调常常使细胞偏向于诱变的TLS，加速基因组多样化。

在癌细胞中，DDT通路选择固有的权衡被利用来在急性复制应激下维持增殖，同时促进遗传多样性。TLS聚合酶的高表达常与不良预后、转移潜能增加和内在治疗耐药相关。易错的TLS聚合酶在损伤旁路过程中引入碱基替换和小片段插入/缺失，直接导致体细胞突变。归因于TLS聚合酶的独特突变特征已在多种癌症类型中被识别。这种TLS驱动的突变发生不仅助长了肿瘤演化，还产生了新抗原，增加了肿瘤免疫原性，并可能增强对免疫检查点阻断（ICB）的应答。此外，DDT使得能够跨越治疗诱导的DNA损伤进行复制，从而使肿瘤细胞能在铂类药物和辐射等治疗中存活。

特定聚合酶相关的化疗耐药和放疗耐药：DDT是获得性治疗耐药的主要决定因素，因为特定的TLS聚合酶直接介导对不同化疗诱导损伤的旁路。例如，Pol η特异性地促进顺铂诱导的DNA加合物的旁路，而Pol κ对于耐受替莫唑胺等药物引起的烷基化损伤至关重要。此外，像Pol η这样的专门聚合酶不仅能绕过离散的DNA损伤，还能积极促进复制通过固有的难以复制的基因组区域，从而驱动遗传变异并促进癌细胞耐受致癌性复制应激。因此，这些特定聚合酶的高表达与降低的治疗敏感性密切相关，而它们的靶向耗竭能深刻地将癌细胞重新敏化至治疗。同样，电离辐射会产生一系列复杂的、阻碍复制的DNA损伤。TLS聚合酶促进持续复制越过阻碍DNA合成的损伤，而复制叉重塑则稳定受损的叉，直到经典DNA修复途径解决更严重的DNA损伤。这些互补机制共同构成了内在放疗抵抗的重要原因。这种独特的聚合酶-损伤关系强调了精准肿瘤学的一个关键概念：DDT抑制剂的选择必须合理地根据患者化疗和放疗方案的具体基因毒性背景来定制。

由于肿瘤本质上依赖DDT来承受内源性复制应激和外源性化疗，靶向该网络为诱导合成致死和抑制耐药提供了前所未有的机会。针对DDT的治疗策略大致可分为三类。

破坏蛋白质-蛋白质相互作用：TLS高度依赖于REV1-Pol ζ复合物的支架性质。诱导REV1 C末端结构域二聚化从而破坏REV1-REV7相互作用的小分子能有效瓦解TLS机器。类似地，一些化合物通过与PCNA相互作用蛋白（PIP）基序竞争PCNA结合来发挥作用。这种方法具有深远的双重优势：它极大地增敏肿瘤对铂类药物的反应，同时剥夺了细胞产生治疗诱导突变的主要机制。

靶向上游调控因子：聚焦于聚合酶上游，去泛素化酶USP1的抑制剂正迅速重塑临床格局。USP1是负责从PCNA上去除单泛素从而限制TLS聚合酶募集的去泛素化酶。USP1抑制剂的临床转化凸显了靶向上游DDT调控因子的巨大潜力。几种首创分子最近已进入人体研究，包括KSQ-4279和AI设计的抑制剂ISM3091。这些化合物目前正在针对携带BRCA1/2突变或其他HR缺陷的晚期实体瘤患者的1期临床试验中进行评估。这些试验的一个关键焦点是测试USP1抑制剂作为单一疗法以及与PARP抑制剂如奥拉帕利协同组合的效果。由于USP1促进PARP1从染色质释放，USP1抑制增强了PARP1在染色质上的捕获，从而最大化复制叉应激。这种双重阻断迫使产生有毒的、不受约束的TLS，同时创造损害BER的条件，提供了一种强大的机制性策略来重新敏化难治性肿瘤并克服获得的PARP抑制剂耐药。在上游调控领域，PARG也通过去PARylation强制p21降解以积极促进癌症进展，从而关键性地调节细胞对复制应激的反应。因此，部署选择性小分子PARG抑制剂呈现出一个有前景的正交治疗策略，以主动诱导复制叉停滞并驱动癌细胞死亡。此外，催化PCNA单泛素化并启动TLS的RAD6-RAD18泛素连接酶复合物的药理学抑制，可减少PCNA泛素化并增强化疗敏感性。这些策略共同通过阻止聚合酶招募所需的上游信号事件来抑制TLS，从而提高DNA损伤疗法的疗效。

利用DNA中的脆弱性：DDT抑制与现有靶向治疗的交叉点集中在复制后ssDNA缺口上。在HR缺陷的肿瘤中，检查点抑制剂通过废除复制应激检查点并允许细胞在复制相关ssDNA缺口得以解决之前通过S期，从而促进大量复制相关ssDNA缺口的积累。虽然经典的TLS聚合酶主要介导损伤旁路，但Pol θ主要在复制后缺口填充和theta介导的末端连接中发挥作用，特别是在HR缺陷的肿瘤中，Pol θ抑制会迫使有丝分裂致死。这一令人信服的生物学原理推动了针对Pol θ不同功能结构域的特异性抑制剂的快速临床开发。例如，重新利用的抗生素新生霉素正在进行1期试验，作为Pol θ ATP酶/解旋酶结构域的特异性别构抑制剂，选择性杀死HR基因改变的肿瘤。同时，基于ART558临床前成功的新型小分子如ART4215已进入临床试验，旨在作为Pol θ聚合酶催化结构域的别构抑制剂。通过积极剥夺癌细胞解决大量复制相关ssDNA缺口的能力，这些Pol θ抑制剂迫使灾难性有丝分裂进入，巩固了它们在HR缺陷临床环境中作为DNA损伤剂和PARP抑制剂强效增敏剂的地位。由于DDT途径对于正常增殖组织中维持基因组完整性也是必需的，治疗选择性是DDT抑制剂临床开发的核心挑战。然而，癌细胞比正常细胞更接近复制灾难的阈值；因此，预计治疗选择性在不同DDT靶点间会有所不同。像Pol θ或特定TLS聚合酶这样的组分可以在经历慢性复制应激或HRD的肿瘤中被优先利用，而抑制广泛必需的复制因子则需要更大的治疗精度以最小化对正常组织的毒性。这些考量进一步强调了生物标志物引导的患者选择对于最大化治疗效果同时最小化毒性的重要性。

DDT抑制剂的成功临床转化可能需要整合基因组、功能和动态DDT指标的生物标志物框架。

HR缺陷和复制应激：现有的HRD评分成功识别出依赖耐受网络的肿瘤。为了使这些框架动态化，必须将它们与复制应激的功能指标相结合，包括RPA包被的ssDNA的积累、R-loop、持续的γ-H2AX和53BP1病灶以及ATR/CHEK1信号的激活。这些功能性读数作为复制应激的间接生物标志物，因为它们识别出那些在复制叉稳定性极限边缘运作、因此高度依赖DDT途径维持活力的肿瘤细胞。

DDT参与的动态指标：超越静态的蛋白水平标志物，非编码RNA引入了预测性生物标志物的动态层面。MicroRNAs如miR-96，积极调节关键DDT和修复组分的表达。分析这些调控RNA可以提供关于肿瘤不断变化的耐受能力的实时预后洞察，反映在序贯治疗过程中通路参与的动态变化。同样，聚合酶的高表达或PCNA在Lys164处单泛素化的增强将捕捉TLS招募通路的活跃参与。

功能性生物标志物和治疗反应：TLS旁路的基因组“化石记录”与肿瘤突变负荷高度相关。由于诱变性旁路产生新抗原，TLS活性谱是预测哪些肿瘤最有可能从DDT抑制剂与ICB联合治疗中获益的预测工具。除了基因组生物标志物，直接测量复制相关ssDNA缺口或持续性BER中间体的功能性生物标志物可能改善患者分层。几种实验方法已被开发用于量化这些功能状态。这些互补检测可能实现对DDT活性的实时评估，并改善超越静态基因组生物标志物的患者分层。

肿瘤依赖性治疗结果：DDT抑制的治疗后果可能是背景依赖性的。肿瘤特异性因素可能共同决定DDT抑制是主要诱导细胞毒性、抑制适应性突变发生，还是增强肿瘤免疫原性。将这些生物学变量与基因组和功能性生物标志物相结合，将有助于选择最有可能从DDT靶向治疗中获益的患者。

新兴证据强调了DDT与肿瘤免疫原性之间的深刻联系。虽然易错损伤旁路直接为新抗原的产生提供燃料，但破坏DDT的结构性后果提供了一个正交的免疫触发因素。未解决的复制应激，因DDT抑制而加剧，可以产生未完全复制的DNA，这些DNA在有丝分裂过程中错误分离进入微核。随后的微核包膜破裂将DNA释放到胞质中，在那里激活先天免疫信号。尽管健康细胞中通常不存在胞质DNA，但持续性复制应激和染色体分离缺陷促进了其在癌细胞中的病理积累。由复制应激产生的胞质DNA被环GMP-AMP合酶（cGAS）感知，后者激活cGAS-STING先天免疫感应机制并启动I型干扰素信号传导。近期证据在胰腺癌中强化了这一范式，其中表观遗传调控因子DPY30在停滞叉处促进H3K4甲基化以保护其稳定性；因此，治疗性或遗传性破坏DPY30会 destabilizes 这些应激叉，触发急性的cGAS-STING介导的炎症，从而强力增敏原本难治的肿瘤对ICB的反应。这些观察提出了一个引人注目的暗示：DDT的靶向调控可能协同增强对免疫疗法的反应。通过同时提高突变驱动的新抗原负担并触发cGAS-STING介导的炎症信号，DDT靶向策略为与ICB联合提供了令人信服的机制依据。然而，确切的临床证据仍然缺乏。因此，免疫启动效应具有深远的临床意义，值得在克服内在化疗耐药和放疗抵抗方面进行测试。由于肿瘤利用DDT在DNA损伤中存活，将DDT抑制剂与放疗结合可能不仅瓦解这种局部的存活机制，还会大规模放大胞质DNA的释放。这种协同的DNA损伤可以超活化cGAS-STING信号，通过驱动细胞毒性淋巴细胞的募集来深刻重塑免疫抑制性肿瘤微环境（TME）。因此，利用DDT抑制与放疗相结合，可以作为高效的引子，将放疗抵抗的、免疫学上的“冷”TME转化为适合ICB的炎性枢纽。